過氧化物酶（Peroxidase，POD）試劑盒說明書 |
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過氧化物酶(Peroxidase，POD)試劑盒說明書 可見分光光度法 試劑的組成： 提取液：液體60mL×1瓶，4℃保存； 試劑一：液體60mL×1瓶，4℃保存； 試劑二：液體×2瓶，4℃保存；用時每瓶加入5mL試劑一；用不完的試劑4℃保存一周； 試劑三：液體10 mL×1瓶，4℃保存。 測定意義： POD（EC 1.11.1.7）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，可催化過氧化氫氧化酚類和胺類化合物，具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用。POD催化H2O2氧化特定底物，在470nm有特征光吸收。 需自備的儀器和用品： 可見分光光度計、臺式離心機、可調式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水 操作步驟：
細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。 組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
測定前將試劑一、二和三37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）放置10min。在1mL玻璃比色皿中按順序加入上述試劑，立即混勻并計時，記錄470nm下30s時的吸光值A1和1min30s后的吸光值A2。計算ΔA＝A2-A1。
注意：
三、POD活性計算：
單位定義：每mL血清（漿）在每mL反應體系中每分鐘A470變化0.01為一個酶活力單位。 計算公式：POD（U/mL）=ΔA×V反總÷V樣÷0.01÷T =7133×ΔA
單位定義：每mg組織蛋白在每mL反應體系中每分鐘A470變化0.01為一個酶活力單位。 POD（U/mg prot）＝ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.01÷T =7133×ΔA÷Cpr
單位定義：每g組織在每mL反應體系中每分鐘A470變化0.01為一個酶活力單位。 POD（U/g 鮮重）＝ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.01÷T =7133×ΔA÷W
單位定義：每1萬個細菌或細胞在每mL反應體系中每分鐘A470變化0.01為一個酶活力單位。 POD（U/104 cell）＝ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.01÷T =14.27×ΔA V反總：反應體系總體積，1.07mL； V樣：加入樣本體積，0.015mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量；500：細菌或細胞總數，500萬。
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